데일리 미생물학 Daily Microbiology 8

Genome-wide functional screens enable the prediction of high activity CRISPR-Cas9 and -Cas12a guides in Yarrowia lipolytica, 2022, Nature Communications

중요성

CRISPR를 이용한 Genome-wide functional gene screening은 E. coli나 mammalian cell line 과 같은 모델 생물에서 새로운 유전자-표현형 관계를 찾거나 새로운 표현형을 만드는데 성공적으로 사용되었다. CRISPR 시스템의 성공은 주로 sgRNA (single guide RNA)의 활성에 달려있으나, 현재 비모델 미생물에서는 높은 활성을 가지는 서열의 sgRNA를 디자인하기 쉽지 않다.

출처:  https://www.bioneer.co.kr/c-life-science/c-ls-p-service/crispr.html

 

목적

• 비모델 생물에서 sgRNA 활성을 정확히 예측할 수 있는 딥러닝 알고리즘을 개발하고자 함 (DeepGuide)
• DeepGuide를 이용해 효모의 한 종류인 Yarrowia lipolytica PO1f 에서
  ① Streptococcus pyogenes Cas9 ② Lachnospiraceae Cas12a 두 종류의 sgRNA  활성을 예측하고자 함
  

*Y. lipolytica 는 바이오매스 유래 당과 산업 폐수(예: 글리세롤, 알칸 및 지방산)를 부가가치가 높은 화학 물질 또는 연료로 전환할 수 있는 잠재력이 있음.

 

균사 상태의 Yarrowia lipolytica

 

방법

1. Cas9 및 Cas12a 의 작동에 필요한 genome-wide sgRNA plasmid vector library를 ① PO1f Δku70 (Control), ② PO1f Cas9 Δku70 및 ③ PO1f Cas12a Δku70 에 삽입해서 배양 후 cutting score(CS) 계산
   * ku70 유전자는 non-homologous end-joining (NHEJ, 맨 처음 그림 참고) 기능을 담당하기 때문에 ku70이 없는 상태에서 CRISPR 절단은 세포 사멸로 이어진다. 따라서 세포가 많이 죽을수록 sgRNA 활성이 좋은 것 = CS 높음
2. 방법 1에서 실제 실험을 통해 얻은 CS와 Genome을 단편화하여 얻은 sgRNA 염기서열은 DeepGuide 의 input 으로 사용하여 실제 CS vs. DeepGuide 에 의해 예측된 CS 값을 비교

 

결과

• DeepGuide 는 기존의 다른 알고리즘에 비해서 CS를 월등히 잘 예측했다 (Pearson correlation 값: Cas9은 0.5, Cas12a는 0.66)

 

결론

DeepGuide의 성능이 완벽하진 않지만, 이를 이용하여 다른 비모델 생물에 대해서도 genome만 있으면 활성이 높은 sgRNA 염기서열을 예측할 수 있음

 

참고문헌

Baisya, D., Ramesh, A., Schwartz, C., Lonardi, S., and Wheeldon, I. (2022). Genome-wide functional screens enable the prediction of high activity CRISPR-Cas9 and -Cas12a guides in Yarrowia lipolytica. Nature Communications 13, 922. 10.1038/s41467-022-28540-0.

 

https://www.bioneer.co.kr/c-life-science/c-ls-p-service/crispr.html